Opracowanie metodyki oceny molekularnej skrzydlaków jesionu wyniosłego pod kątem obecności patogenu
Opracowanie metodyki oceny molekularnej skrzydlaków jesionu wyniosłego pod kątem obecności patogenu Hymenoscyphus fraxineus. W celu potwierdzenia efektywności procesu termoterapii i krioterapii w zwalczaniu patogenu Hymenoscyphus fraxineus - próbki nasion poddane zostały dwóm ocenom: hodowli in vitro na specjalnym podłożu hodowlanym oraz analizie molekularnej pod kątem obecności materiału genetycznego patogenu.
W związku z realizacją projektu „Zachowanie różnorodności biologicznej siedlisk obszarów NATURA 2000, poprzez ochronę ex situ jesionu wyniosłego, wiązu górskiego, wiązu pospolitego oraz wiązu szypułkowego na terenie Polski” (FraxUmLBG) w Pracowni Analizy DNA opracowano metodykę, dzięki której możliwa jest szybka identyfikacja patogenu Hymenoscyphus fraxineus. Materiałem wyjściowym były fragmenty skrzydlaków jesionu wyniosłego, które wcześniej poddane zostały procesom krioterapii i termoterapii.
W ramach opracowania metodyki wykonano:
- Izolację DNA;
- Przegląd literatury fachowej, zakupiono markery molekularne do diagnostyki patogenu;
- Reakcję PCR z wykorzystaniem markerów molekularnych do wykrycia DNA patogenu;
- Analizę otrzymanych wyników.
Pierwszym etapem prac była izolacja DNA, do której wykorzystuje się komercyjne zestawy odczynników. Następnie uzyskane DNA amplifikuje się w reakcji PCR (Fot. 1, 2). Podczas tego procesu do nici DNA przyłączane zostają również markery molekularne- znakowane fluorescencyjnie. W końcowym etapie wyniki odczytywane są przy użyciu analizatora genetycznego.
Fot. 1. Izolacja DNA nasion jesionu wyniosłego (fot. A. Pasławska).
Fot. 2. Stanowisko do izolacji DNA (fot. M. Chudzińska).
Z pierwotnej puli dziewięciu markerów molekularnych, ostatecznie wybrano 4 (Ryc.1) . Materiałem, na którym testowano przydatność markerów były: kora pędów jesionu wyniosłego, skrzydlaki oraz pąki zimowe.
Otrzymywane wyniki porównano z wynikami uzyskanymi po wykorzystaniu jako matrycy- laboratoryjnie wyhodowanego szczepu H.fraxineus oraz innych grzybów np. włosianki rosistej (Hebeloma crustuliniforme) czy pieczarki (Agaricus L.).
Ostatecznie- ocena skuteczności krioterapii i termoterapii przeprowadzona zostanie na skrzydlakach jesionu wyniosłego, pochodzących z 17 stanowisk w Polsce.
Połączenie metody klasycznej z metodą molekularną oceny skuteczności zabiegów eliminujacych patogen- pozwoli na wybranie najbardziej optymalnej metody dla bezpiecznego, długotrwałego przechowania materiału nasiennego w LBG Kostrzyca.
Magdalena Chudzińska
